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western blot 相关试剂及步骤.doc

western blot 相关试剂及步骤

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2019-05-22 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《western blot 相关试剂及步骤doc》,可适用于外语资料领域

WesternBlot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集(一)器材和试剂准备:镊子、眼科剪、乙醇(三蒸水配制)、mL离心管、液氮(二)步骤(以心脏为例):、脱颈椎处死小鼠读取小鼠编号、乙醇消毒胸部剪开胸腔剪下心脏(一颗心脏约mg)排除血液放入离心管投入液氮中、组织于摄氏度冻存二、组织蛋白的提取:(一)器材和试剂准备:mL离心管、mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液(RadioImmunoprecipitationAssay详见下载的网页)(碧云天公司)、PMSF(Phenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟详见下载的网页prod号ThermoScientific)、乙醇、三蒸水(二)步骤、准备好三管mL乙醇、一管三蒸水取出RIPA和PMSF解冻、按照mLPIRA:uLPMSF:mg组织的比例加试剂和组织于mL离心管、按照三管mL乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头(每管秒)再研磨组织上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止、静置于冰盒分钟、rpm摄氏度分钟、先取uL上清于离心管再取uL上清于离心管。前者用于测试后者备用。摄氏度冻存。注意:购置的RIPA不宜反复冻融需分装摄氏度保存PMSF为晶体状购置后按照说明书溶于异丙醇分装摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白(BCAproteinassaykitProd号详见下载的网页ThermoScientific):(一)器材和试剂准备:mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液(二)步骤、详见BCAProteinAssayKitpdf使用说明书配制溶液制作标准曲线测定蛋白浓度。(加好各试剂混合于摄氏度放置分钟)、使用AmershamBiosciencesGeneQuantPro分光光度计的nm测试读数三次取平均值(ugmL)四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制(各浓度的配制见配方表)SDSPAGE试剂配制)丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺(Acrylamide)g  亚甲双丙烯酰胺(BisAcrylamide)g  dddHO℃溶解定容至ml棕色瓶存于℃。)分离胶缓冲液molLTrisHcl(PH)TrisgmolLHCL调节PH(可以使用分析纯级别的浓盐酸下同)dddHO定容至mL℃保存)浓缩胶缓冲液molLTrisHcl(PH):TrisgmolLHCL调节PHdddHO定容至mL℃保存)SDS溶液:SDSgdddHO定容至ml室温保存)过硫酸铵(AP):过硫酸铵gdddHO定容至ml℃保存要在一周内使用最好新鲜配制)TEMED遮光保存分装于EP管冻存五、电泳(一)器材和试剂准备:电泳仪、电磁锅、浮板、离心机、mL离心管、Marker、times上样缓冲液(loadingbuffer)、生理盐水、电泳液(二)步骤、电泳上样体系总uL(即每孔加uL):(下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂) Marker管(泳道)蛋白样品管(泳道)空白管(泳道)蛋白无?无timesloadingbufferuLuLuLMarkeruL无无生理盐水uL补齐至uLuL体系总体积uLuLuLMarker条带依次是、、、(red)、、、、、、(green)KD大小的梯度。蛋白样品管的上样量的计算:ug(这个值不一定的可以根据算出的体积来改变。比如超过uL则需要减少上样量。而且如果内参不齐时也需要调整)除以依据分光光度计的读数算出的蛋白浓度ugmL(根据说明书蛋白以:被稀释)再转换成uL的单位。空白管的设置是因为当蛋白样品少于个样品时空出的孔需要加入物质以免蛋白跑偏。、根据上表加好各试剂后于摄氏度水浴分钟离心再上样倒入电泳液、上层胶V跑下层胶V跑(一般至少个半小时)六、转膜(一)器材和试剂准备:电转仪、电转液、冰块(二)步骤、准备夹板、滤纸、NC膜(浸泡于电转液)、取出凝胶切下蛋白和marker所在的凝胶制成由下到上依次是:滤纸、凝胶、NC膜、滤纸的夹板。放置各层时注意要加电转液湿润并排出气泡以免干扰电转效果。放入电转仪加入冰块和电转液mA恒流电转小时。、封闭(一)器材和试剂准备:丽春红染料、脱脂牛奶、TBST、塑料盒、镊子、剪刀、摇床(二)步骤、取出夹板用镊子夹出NC膜置于丽春红染料中分钟、取出NC膜可以观察一下条带是否均匀、有无跑偏用剪刀剪去周围空白并在左下角剪一斜角。用蒸馏水洗去丽春染料。TBST配置脱脂牛奶放入NC膜于摇床上慢摇小时八、一抗孵育(一)器材和试剂准备:塑料膜、封塑机、一抗、TBST(二)步骤、根据NC膜的大小剪出一张双层的塑料膜取出NC膜置于塑料膜中封闭塑料膜的三边制成一个袋子、按照一定比例稀释一抗后加入塑料膜袋排气泡封闭塑料膜开口、NC膜正面朝下放置于慢摇的摇床分钟再放入摄氏度的慢摇摇床过夜九、二抗孵育(一)器材和试剂准备:二抗、TBST、剪刀、摇床(二)步骤、取出NC膜于常温慢摇的摇床分钟剪开塑料膜用TBST洗涤次每次分钟(调节摇床至快摇)、按照说明书准备二抗的稀释液一种是目的蛋白的一种是内参的。、洗完NC膜后将膜剪开分别放入目的蛋白和内参的二抗稀释液于慢摇的摇床孵育小时。、显色曝光(采用辣根过氧化物酶HRPECL发光法)(一)器材和试剂准备:WesternBlottingLuminolReagent测试剂盒(SANTACRUZBITECHNOLOGYInt,sc)、片盒、柯达xomatBt医用x射线胶片(型号:xbt规格(cm):xcm)、KodakXOMATPROCESSOR(洗片机)(二)步骤、取出NC膜用TBST洗涤次每次分钟(调节摇床至快摇)、用TBS润洗NC膜放入有保鲜膜的片盒中、将A、B发光液:比例混合加入NC膜盖上保鲜膜和片盒的盖子、到暗室打开片盒擦去保鲜膜周边的发光液放入胶片盖上片盒盖子分别压秒、秒、分钟胶片放入洗片机、取出胶片后对着NC膜标上marker的位置丽春红染液丽春红g冰醋酸mLdHO定容至mLWesternblot中三种溶液的配制:电泳液:     times储备液(pH):Trisgtimes工作液:times储备液mL 甘氨酸gHOmL SDSg  HO定容至L    电转液:     times储备液:Trisgtimes工作液:times储备液mL 甘氨酸gHOmL HO定容至L  甲醇mLTBST:     times储备液:Trisgtimes工作液:times储备液mL NaCLgHOmL 调节pH到(L约加mLHCL)TweenmL HO定容至L  TBS:不加Tween     timesSDSPAGELoadingBuffer配制方法(mL体系总体积):  DTT(DLDithiothreitol二硫苏糖醇)(M)gSDS(sodiumdodecylsulfate) g  MTrisCL(pH)mL溶解后加入mL甘油及少量溴酚蓝定容至mL

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